د PCR عکس العملونو کې د مداخلې عوامل

د PCR غبرګون په جریان کې، ځینې مداخله کونکي فکتورونه اکثرا ورسره مخ کیږي.
د PCR د خورا لوړ حساسیت له امله، ککړتیا یو له خورا مهم فکتورونو څخه شمیرل کیږي چې د PCR پایلې اغیزه کوي او کولی شي غلط مثبت پایلې تولید کړي.
په مساوي ډول مهمې مختلفې سرچینې دي چې د غلط - منفي پایلو لامل کیږي.که چیرې د PCR مخلوط یو یا څو اړین برخې یا د امپلیفیکیشن عکس العمل پخپله منع شي یا مداخله وکړي، د تشخیص ارزونه خنډ کیدی شي.دا کولی شي د موثریت کمولو او حتی غلط منفي پایلو لامل شي.
د مخنیوي سربیره، د هدف نیوکلیک اسید بشپړتیا له لاسه ورکول ممکن د نمونې چمتو کولو دمخه د بار وړلو او / یا ذخیره کولو شرایطو له امله پیښ شي.په ځانګړې توګه، د تودوخې لوړه درجه یا ناکافي ذخیره کولی شي د حجرو او نیوکلیک اسیدونو زیانمن کړي.د حجرو او نسجونو تنظیم کول او د پارافین سرایت د DNA ټوټې کیدو او دوامداره ستونزې پیژندل شوي لاملونه دي (شکل 1 او 2 وګورئ).په دې قضیو کې، حتی غوره جلا کول او پاکول به مرسته ونه کړي.

شکل 1 |د DNA بشپړتیا باندې د حرکت کولو اغیزه
د Agarose gel electrophoresis ښودلې چې د DNA کیفیت د آټوپسیز پارافین برخو څخه جلا شوی د پام وړ توپیر لري.په استخراج کې د مختلف اوسط ټوټو اوږدوالی DNA شتون درلود چې د تنظیم کولو میتود پورې اړه لري.DNA یوازې هغه وخت ساتل کیده کله چې په اصلي منجمد نمونو او بفر شوي غیر جانبدار فارمیلین کې ثابت شي.د قوي اسیدیک بوین فکسټیک یا غیر بفر شوي ، فارمیک اسید لرونکي فارملین کارول د DNA د پام وړ زیان لامل شوی.پاتې برخه ډیره ټوټه شوې ده.
په ښي خوا کې، د ټوټو اوږدوالی د کیلوبیس جوړه (kbp) کې څرګند شوی

انځور 2 |د نیوکلیک اسید اهدافو بشپړتیا له لاسه ورکول
(a) په دواړو غاړو کې د 3′-5′ واټن به په نښه شوي DNA کې د ماتیدو لامل شي.د DNA ترکیب به لاهم په کوچنۍ ټوټه کې واقع شي.په هرصورت، که چیرې د پرائمر انیل کولو سایټ د DNA ټوټه کې ورک وي، یوازې خطي پراخوالی واقع کیږي.په خورا مناسب حالت کې، ټوټې کیدای شي یو بل سره بیا ځای پرځای شي، مګر حاصلات به کوچني او د کشف کچې څخه ښکته وي.
(b) د بندونو له لاسه ورکول، په عمده توګه د depurination او thymidine dimer جوړیدو له امله، د H-bonds په شمیر کې کمښت او د Tm کمښت المل کیږي.د اوږدې تودوخې مرحلې په جریان کې، پرائمرونه به د میټریکس DNA څخه لیرې شي او حتی په لږ سختو شرایطو کې به انیل نه شي.
(c) د تایمین سره نږدې اډې د TT ډیمر جوړوي.
بله عامه ستونزه چې ډیری وختونه په مالیکولر تشخیص کې پیښیږي د فینول-کلوروفارم استخراج په پرتله د هدف نیوکلیک اسیدونو لږ تر ټولو غوره خوشې کول دي.په سختو قضیو کې، دا د غلط منفي سره تړاو لري.ډیر وخت د جوش کولو لیسیز یا د حجرو د کثافاتو انزایمیک هضم کولو سره خوندي کیدی شي، مګر دا طریقه اکثرا د ناکافي نیوکلیک اسید خوشې کیدو له امله د PCR حساسیت کموي.

د پراخیدو پرمهال د پولیمیریز فعالیت مخنیوی

په عموم کې، مخنیوی د کانټینر مفهوم په توګه کارول کیږي ترڅو ټول هغه فکتورونه تشریح کړي چې د PCR suboptimal پایلو المل کیږي.په سخته بیولوژیکي مفهوم کې، مخنیوی د انزایم فعالیت پورې محدود دی، د بیلګې په توګه، دا د DNA پولیمیریز یا د هغې کوفیکٹر (د مثال په توګه، Mg2+ د Taq DNA پولیمیریز لپاره) سره د تعامل له لارې د سبسټریټ محصول تبادله کموي یا مخنیوی کوي.
په نمونه کې اجزاوې یا مختلف بفرونه او استخراجونه چې ریجنټ لري کولی شي مستقیم انزایم منع کړي یا د هغې کوفکتورونه (د مثال په توګه EDTA) ودروي، په دې توګه پولیمیریز غیر فعالوي او په پایله کې د PCR منفي یا غلط منفي پایلې کموي.
په هرصورت، د عکس العمل اجزاو او هدف لرونکي نیوکلیک اسیدونو ترمنځ ډیری تعامل هم د PCR مخنیوی کونکي په توګه نومول شوي.یوځل چې د حجرې بشپړتیا د جلا کیدو له امله ګډوډ شي او نیوکلیک اسید خوشې شي، د نمونې او د هغې شاوخوا محلول او جامد پړاو ترمنځ تعامل واقع کیدی شي.د مثال په توګه، 'سکاینجرز' کولی شي د غیر متقابل تعامل له لارې واحد یا دوه اړخیزه DNA وتړي او د هدفونو شمیر کمولو سره په جلا کولو او پاکولو کې مداخله وکړي چې په پای کې د PCR عکس العمل رګ ته رسیږي.
په عموم کې، د PCR مخنیوی کونکي د بدن په ډیرو مایعاتو او ریجنټونو کې شتون لري چې د کلینیکي تشخیصي ازموینو لپاره کارول کیږي (په ادرار کې یوریا، هیموګلوبین او په وینه کې هیپرین)، د غذايي موادو (عضوي اجزا، ګلایکوجن، غوړ، Ca2+ آئن) او په چاپیریال کې اجزا (فینول) درانه فلزات)

ډیر عام PCR مخنیوی کونکي په باکتریا او یوکریوټیک حجرو کې موندل کیدی شي ، غیر هدف شوي DNA ، د نسج میټریکونو DNA پابند میکرومولیکولونه او د لابراتوار تجهیزات لکه دستکشې او پلاستیک.د استخراج پرمهال یا وروسته د نیوکلیک اسیدونو پاکول د PCR مخنیوی کونکو لرې کولو غوره میتود دی.
نن ورځ، د استخراج مختلف اتومات تجهیزات کولی شي ډیری لارښود پروتوکولونه ځای په ځای کړي، مګر 100٪ بیا رغونه او / یا د اهدافو پاکول هیڅکله ندي ترلاسه شوي.احتمالي مخنیوی کونکي ممکن لاهم په پاک شوي نیوکلیک اسیدونو کې شتون ولري یا ممکن دمخه تاثیر کړي.د مخنیوی کونکو اغیزو کمولو لپاره مختلف ستراتیژۍ شتون لري.د مناسب پولیمریز انتخاب کولی شي د مخنیوي فعالیت باندې د پام وړ اغیزه ولري.د PCR مخنیوی کمولو لپاره نورې ثابتې میتودونه د پولیمیریز غلظت زیاتول یا د BSA په څیر د اضافه کولو کارول دي.
د PCR عکس العملونو مخنیوی د داخلي پروسې کیفیت کنټرول (IPC) په کارولو سره ښودل کیدی شي.
د استخراج په کټ کې ټول ریجنټ او نور محلولونه لکه ایتانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، isopropanol او فینول د نیوکلیک اسید څخه د بشپړ مینځلو په واسطه جلا کولو لپاره باید پاملرنه وشي.د دوی په غلظت پورې اړه لري، دوی ممکن PCR فعال یا منع کړي.