د PCR عکس العملونو کې د مداخلې عوامل

د PCR غبرګون په جریان کې، ځینې مداخله کونکي فکتورونه اکثرا ورسره مخ کیږي.
د PCR د خورا لوړ حساسیت له امله، ککړتیا یو له خورا مهم فکتورونو څخه شمیرل کیږي چې د PCR پایلې اغیزه کوي او کولی شي غلط مثبت پایلې تولید کړي.
په مساوي ډول مهمې مختلفې سرچینې دي چې د غلط - منفي پایلو لامل کیږي. که چیرې د PCR مخلوط یو یا څو اړین برخې یا د امپلیفیکیشن عکس العمل پخپله منع شي یا مداخله وکړي، د تشخیص ارزونه خنډ کیدی شي. دا کولی شي د موثریت کمولو او حتی غلط منفي پایلو لامل شي.
د مخنیوي سربیره، د هدف نیوکلیک اسید بشپړتیا له لاسه ورکول ممکن د نمونې چمتو کولو دمخه د بار وړلو او / یا ذخیره کولو شرایطو له امله پیښ شي. په ځانګړې توګه، د تودوخې لوړه درجه یا ناکافي ذخیره کولی شي د حجرو او نیوکلیک اسیدونو زیانمن کړي. د حجرو او نسجونو تنظیم کول او د پارافین سرایت د DNA ټوټې کیدو او دوامداره ستونزې پیژندل شوي لاملونه دي (شکل 1 او 2 وګورئ). په دې قضیو کې، حتی غوره جلا کول او پاکول به مرسته ونه کړي.

شکل 1 | د DNA بشپړتیا باندې د حرکت کولو اغیزه
د Agarose gel electrophoresis ښودلې چې د DNA کیفیت د آټوپسیز پارافین برخو څخه جلا شوی د پام وړ توپیر لري. په استخراج کې د مختلف اوسط ټوټو اوږدوالی DNA شتون درلود چې د تنظیم کولو میتود پورې اړه لري. DNA یوازې هغه وخت ساتل کیده کله چې په اصلي منجمد نمونو او بفر شوي غیر جانبدار فارمیلین کې ثابت شي. د قوي اسیدیک بوین فکسټیک یا غیر بفر شوي ، فارمیک اسید لرونکي فارملین کارول د DNA د پام وړ زیان لامل شوی. پاتې برخه ډیره ټوټه شوې ده.
په ښي خوا کې، د ټوټو اوږدوالی د کیلوبیس جوړه (kbp) کې څرګند شوی

انځور 2 | د نیوکلیک اسید اهدافو بشپړتیا له لاسه ورکول
(a) په دواړو غاړو کې د 3′-5′ واټن به په نښه شوي DNA کې د ماتیدو لامل شي. د DNA ترکیب به لاهم په کوچنۍ ټوټه کې واقع شي. په هرصورت، که چیرې د پرائمر انیل کولو سایټ د DNA ټوټه کې ورک وي، یوازې خطي پراخوالی واقع کیږي. په خورا مناسب حالت کې، ټوټې کیدای شي یو بل سره بیا ځای پرځای شي، مګر حاصلات به کوچني او د کشف کچې څخه ښکته وي.
(b) د بندونو له لاسه ورکول، په عمده توګه د depurination او thymidine dimer جوړیدو له امله، د H-bonds په شمیر کې کمښت او د Tm کمښت المل کیږي. د اوږدې تودوخې مرحلې په جریان کې، پرائمرونه به د میټریکس DNA څخه لیرې شي او حتی په لږ سختو شرایطو کې به انیل نه شي.
(c) د تایمین سره نږدې اډې د TT ډیمر جوړوي.
بله عامه ستونزه چې ډیری وختونه په مالیکولر تشخیص کې پیښیږي د فینول-کلوروفارم استخراج په پرتله د هدف نیوکلیک اسیدونو لږ تر ټولو غوره خوشې کول دي. په سختو قضیو کې، دا د غلط منفي سره تړاو لري. ډیر وخت د جوش کولو لیسیز یا د حجرو د کثافاتو انزایمیک هضم کولو سره خوندي کیدی شي، مګر دا طریقه اکثرا د ناکافي نیوکلیک اسید خوشې کیدو له امله د PCR حساسیت کموي.

د پراخیدو پرمهال د پولیمیریز فعالیت مخنیوی

په عموم کې، مخنیوی د کانټینر مفهوم په توګه کارول کیږي ترڅو ټول هغه فکتورونه تشریح کړي چې د PCR suboptimal پایلو المل کیږي. په سخته بیولوژیکي مفهوم کې، مخنیوی د انزایم فعالیت پورې محدود دی، د بیلګې په توګه، دا د DNA پولیمیریز یا د هغې کوفیکٹر (د مثال په توګه، Mg2+ د Taq DNA پولیمیریز لپاره) سره د تعامل له لارې د سبسټریټ محصول تبادله کموي یا مخنیوی کوي.
په نمونه کې اجزاوې یا مختلف بفرونه او استخراجونه چې ریجنټ لري کولی شي مستقیم انزایم منع کړي یا د هغې کوفکتورونه (د مثال په توګه EDTA) ودروي، په دې توګه پولیمیریز غیر فعالوي او په پایله کې د PCR منفي یا غلط منفي پایلې کموي.
په هرصورت، د عکس العمل اجزاو او هدف لرونکي نیوکلیک اسیدونو ترمنځ ډیری تعامل هم د PCR مخنیوی کونکي په توګه نومول شوي. یوځل چې د حجرې بشپړتیا د جلا کیدو له امله ګډوډ شي او نیوکلیک اسید خوشې شي، د نمونې او د هغې شاوخوا محلول او جامد پړاو ترمنځ تعامل واقع کیدی شي. د مثال په توګه، 'سکاینجرز' کولی شي د غیر متقابل تعامل له لارې واحد یا دوه اړخیزه DNA وتړي او د هدفونو شمیر کمولو سره په جلا کولو او پاکولو کې مداخله وکړي چې په پای کې د PCR عکس العمل رګ ته رسیږي.
په عموم کې، د PCR مخنیوی کونکي د بدن په ډیری مایعاتو او ریجنټونو کې شتون لري چې د کلینیکي تشخیصي ازموینو لپاره کارول کیږي (په ادرار کې یوریا، هیموګلوبین او په وینه کې هیپرین)، د غذایي موادو (عضوي اجزا، ګلایکوجن، غوړ، Ca2+ ions) او په چاپیریال کې اجزا (فینول) درانه فلزات)

ډیر عام PCR مخنیوی کونکي په باکتریا او یوکریوټیک حجرو کې موندل کیدی شي ، غیر هدف شوي DNA ، د نسج میټریکونو DNA پابند میکرومولیکولونه او د لابراتوار تجهیزات لکه دستکشې او پلاستیک. د استخراج پرمهال یا وروسته د نیوکلیک اسیدونو پاکول د PCR مخنیوی کونکو لرې کولو غوره میتود دی.
نن ورځ، د استخراج مختلف اتومات تجهیزات کولی شي ډیری لارښود پروتوکولونه ځای په ځای کړي، مګر 100٪ بیا رغونه او / یا د اهدافو پاکول هیڅکله ندي ترلاسه شوي. احتمالي مخنیوی کونکي ممکن لاهم په پاک شوي نیوکلیک اسیدونو کې شتون ولري یا ممکن دمخه تاثیر کړي. د مخنیوی کونکو اغیزو کمولو لپاره مختلف ستراتیژۍ شتون لري. د مناسب پولیمریز انتخاب کولی شي د مخنیوي فعالیت باندې د پام وړ اغیزه ولري. د PCR مخنیوی کمولو لپاره نورې ثابتې میتودونه د پولیمیریز غلظت زیاتول یا د BSA په څیر د اضافه کولو کارول دي.
د PCR عکس العملونو مخنیوی د داخلي پروسې کیفیت کنټرول (IPC) په کارولو سره ښودل کیدی شي.
د استخراج په کټ کې د ټولو ریاجنټونو او نورو محلولونو لکه ایتانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، isopropanol او فینول د لیرې کولو لپاره باید پاملرنه وشي، د نیوکلیک اسید څخه د بشپړ مینځلو ګام په واسطه جلا کړئ. د دوی په غلظت پورې اړه لري، دوی ممکن PCR فعال یا منع کړي.