د PCR تعاملاتو کې د مداخلې عوامل

د PCR غبرګون په جریان کې، ځینې مداخله کوونکي عوامل ډیری وختونه ورسره مخ کیږي.
د PCR د خورا لوړ حساسیت له امله، ککړتیا د PCR پایلو باندې اغیزه کولو یو له خورا مهم فکتورونو څخه ګڼل کیږي او کولی شي غلط مثبت پایلې تولید کړي.
په مساوي ډول هغه مختلفې سرچینې مهمې دي چې د غلط منفي پایلو لامل کیږي. که چیرې د PCR مخلوط یو یا څو اړینې برخې یا د امپلیفیکیشن غبرګون پخپله مخنیوی شي یا مداخله وشي، نو د تشخیصي ازموینې مخه نیول کیدی شي. دا کولی شي د موثریت کمولو او حتی غلط منفي پایلو لامل شي.
د مخنیوي سربیره، د نمونې چمتو کولو دمخه د لیږد او/یا ذخیره کولو شرایطو له امله د هدف نیوکلیک اسید بشپړتیا له لاسه ورکول ممکن پیښ شي. په ځانګړي توګه، لوړه تودوخه یا ناکافي ذخیره کول ممکن د حجرو او نیوکلیک اسیدونو زیان لامل شي. د حجرو او نسجونو تنظیم او د پارافین ځای پرځای کول د DNA ټوټې کیدو او دوامداره ستونزې پیژندل شوي لاملونه دي (شکلونه 1 او 2 وګورئ). پدې قضیو کې، حتی غوره جلا کول او پاکول به مرسته ونکړي.

شکل ۱ | د DNA بشپړتیا باندې د بې حرکتۍ اغیز
د اګاروز جیل الیکروفوریسس ښودلې چې د آټوپسي د پارافین برخو څخه جلا شوي DNA کیفیت د پام وړ توپیر درلود. د فکسیشن میتود پورې اړه لري د مختلف اوسط ټوټې اوږدوالي DNA په استخراج کې شتون درلود. DNA یوازې هغه وخت ساتل کیده کله چې په اصلي منجمد نمونو او بفر شوي غیر جانبدار فارملین کې تنظیم شي. د قوي اسیدیک بوین فکسیټیو یا غیر بفر شوي، فارمیک اسید لرونکي فارملین کارول د DNA د پام وړ ضایع کیدو لامل شو. پاتې برخه خورا ټوټه شوې ده.
په چپ اړخ کې، د ټوټو اوږدوالی په کیلوبیس جوړو (kbp) کې ښودل شوی.

شکل ۲ | د نیوکلیک اسید هدفونو د بشپړتیا له لاسه ورکول
(a) په دواړو تارونو کې د 3′-5′ واټن به د هدف DNA د ماتیدو لامل شي. د DNA ترکیب به لاهم په کوچنۍ ټوټه کې واقع شي. په هرصورت، که چیرې د DNA په ټوټه کې د پرائمر انیل کولو ځای ورک وي، یوازې خطي امپلیفیکیشن واقع کیږي. په خورا مناسب حالت کې، ټوټې ممکن یو بل بیا مشبوع کړي، مګر حاصلات به کوچني او د کشف کچې څخه ښکته وي.
(ب) د اساساتو له لاسه ورکول، په عمده توګه د پاکوالي او تایمایډین ډایمر جوړیدو له امله، د H-بانډونو شمیر کمولو او په Tm کې کمښت لامل کیږي. د اوږدې تودوخې مرحلې په جریان کې، پرائمرونه به د میټریکس DNA څخه منحل شي او حتی د لږ سختو شرایطو لاندې به انیل نه شي.
(c) د تایمین سره نږدې اساسات د TT ډایمر جوړوي.
یوه بله عامه ستونزه چې ډیری وخت په مالیکولي تشخیص کې پیښیږي د فینول-کلوروفارم استخراج په پرتله د هدف نیوکلیک اسیدونو څخه لږ غوره خوشې کول دي. په سختو قضیو کې، دا د غلط منفي سره تړاو لري. د حجرو د کثافاتو د جوش کولو لیسیس یا انزایمیک هضم له لارې ډیر وخت خوندي کیدی شي، مګر دا طریقه ډیری وختونه د ناکافي نیوکلیک اسید خوشې کیدو له امله د PCR حساسیت ټیټوي.

د امپلیفیکیشن په جریان کې د پولیمیریز فعالیت مخنیوی

په عمومي توګه، مخنیوی د کانټینر مفهوم په توګه کارول کیږي ترڅو ټول هغه عوامل تشریح کړي چې د PCR پایلو د کمولو لامل کیږي. په کلکه بایو کیمیکل معنی کې، مخنیوی د انزایم فعالیت پورې محدود دی، د بیلګې په توګه، دا د DNA پولیمیریز فعال سایټ یا د هغې کوفیکٹر سره د تعامل له لارې د سبسټریټ محصول بدلون کموي یا مخنیوی کوي (د مثال په توګه، د Taq DNA پولیمیریز لپاره Mg2+).
په نمونه کې اجزا یا مختلف بفرونه او استخراجونه چې ریجنټونه لري کولی شي په مستقیم ډول انزایم منع کړي یا د هغې کوفیکٹرونه (د بیلګې په توګه EDTA) بند کړي، په دې توګه پولیمیریز غیر فعالوي او په پایله کې د PCR پایلو کمیدو یا غلط منفي کیدو لامل کیږي.
په هرصورت، د غبرګون اجزاو او هدف لرونکي نیوکلیک اسیدونو ترمنځ ډیری تعاملات د 'PCR مخنیوی کونکو' په توګه هم نومول شوي دي. کله چې د حجرو بشپړتیا د جلا کیدو له امله ګډوډ شي او نیوکلیک اسید خوشې شي، د نمونې او د هغې شاوخوا محلول او جامد پړاو ترمنځ تعاملات واقع کیدی شي. د مثال په توګه، 'سکاینجرز' کولی شي د غیر همغږه تعاملاتو له لارې واحد یا دوه ګونی بند شوی DNA وتړي او د هغو هدفونو شمیر کمولو سره چې بالاخره د PCR غبرګون رګ ته رسیږي د جلا کیدو او پاکولو سره مداخله وکړي.
په عمومي توګه، د PCR مخنیوی کونکي په ډیری بدني مایعاتو او ریجنټونو کې شتون لري چې د کلینیکي تشخیصي ازموینو لپاره کارول کیږي (په ادرار کې یوریا، په وینه کې هیموګلوبین او هیپرین)، د غذايي موادو بشپړونکي (عضوي اجزا، ګلایکوجن، غوړ، Ca2+ ایونونه) او په چاپیریال کې اجزا (فینولونه، درانه فلزات).

د PCR ډیر عام مخنیوی کونکي په باکتریا او یوکاریوټیک حجرو، غیر هدفي DNA، د نسج میټریکسونو DNA-بندونکي میکرو مالیکولونو او لابراتوار تجهیزاتو لکه دستکشې او پلاستیک کې موندل کیدی شي. د استخراج پرمهال یا وروسته د نیوکلیک اسیدونو پاکول د PCR مخنیوی کونکو لرې کولو لپاره غوره میتود دی.
نن ورځ، د استخراج مختلف اتومات تجهیزات کولی شي ډیری لاسي پروتوکولونه ځای په ځای کړي، مګر د اهدافو 100٪ بیا رغونه او/یا پاکول هیڅکله نه دي ترلاسه شوي. احتمالي مخنیوی کونکي ممکن لاهم په پاک شوي نیوکلیک اسیدونو کې شتون ولري یا ممکن دمخه اغیزمن شوي وي. د مخنیوي کونکو اغیز کمولو لپاره مختلف ستراتیژۍ شتون لري. د مناسب پولیمیریز انتخاب کولی شي د مخنیوي کونکو فعالیت باندې د پام وړ اغیزه ولري. د PCR مخنیوی کمولو لپاره نورې ثابتې شوې میتودونه د پولیمیریز غلظت زیاتول یا د BSA په څیر اضافه کونکي پلي کول دي.
د PCR تعاملاتو مخنیوی د داخلي پروسې کیفیت کنټرول (IPC) په کارولو سره ښودل کیدی شي.
د نیوکلیک اسید جلا کولو څخه د بشپړ مینځلو مرحلې په واسطه د استخراج کټ کې ټول ریجنټونه او نور محلولونه، لکه ایتانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، isopropanol او phenol، لرې کولو لپاره باید پاملرنه وشي. د دوی غلظت پورې اړه لري، دوی ممکن PCR فعال یا منع کړي.